PERAN ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI

Dalam Bioteknologi modern menyatukan 2 gen dalam Rekayasa genetika adalah harus dilakukan , ini untuk suatu terobosan cepat dengan akurasi ketepatan 100% yang jauh berbeda dengan penggabungan gen melalui genetika (mendelism) yang hanya menghasilkan 6,25%. Namun anda harus tahu gimana menggunting gen yang harus disatukan , bagaimana menyambungkan ke dua gen itu.
Prinsip dasar inilah yang kemudian dilakukan untuk improvisasi terbentuknya organisme / sel yang lebih unggul yang bervariasi (kerennya mutan yang setiap detik muncul)
JADI yang dilakukan
POTONG DNA A + POTONG DNA B -- satukan dalam untaian 1 DNA baru titipkan pada sel (organisme Vektor)-- silahkan berkembang -- jika sukses terbentuk varian sel -- Ekstrak hasilnya
ada 2 teknik penyatuan gen
1. Teknik Plasmid
2. Teknik Hibridoma
Untuk Teknik Plasmid kami akan berikan gambar dibawah ini
Bahan : plasmid (DNA melingkar) Bakteri E.coly
Sel Pancreas - (DNA nya)
Alat : guntingnya Enzim Endonuklease Restriksi
Penyambung DNA nya Enzim Ligase
Mekanisme kerja lihat gambar
Hasil : bakteri yang digunakan sebagai vektor bisa menghasilkan insulin karena DNA pancreas yang memberikan karakter yang disatukan di DNA bakteri .OK




REFRENSI

Asam nukleat baik DNA maupun RNA mampu dipotong dengan menggunakan suatu enzim yaitu nuklease. Enzim nuklease yang mampu memotong RNA disebut ribonuklease atau Rnase, sementara enzim yang mampu memotong DNA disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Beberapa nuklease hanya memotong urutan asam nukleat yang single strand dan apa pula yang mampu memotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua macam yakni eksonuklease yang mampu memotong molekul asam nukleat single strand atau beberapa oligonukleotida pendek yang hanya mengenali salah satu ujung asam nukleat, yaitu ujung 5′  atau ujung 3′; sementara endonuklease mampu memotong asam nukleat di dareah tengah daru sekuens asam nukleat yang mampu mengenali daerah spesifik pada urutan asam nukleat (Clark, 2010; Howe, 2007; Murray et al., 2009).

Salah tujuan untuk memperoleh suatu daerah DNA dalam suatu genom adalah untuk melakukan perbanyakan (kloning). Untuk memperoleh suatu urutan DNA tersebut maka dilakukan pemotongan genom DNA menjadi fragmen-fragmen dengan menggunakan enzim tertentu yang mampu memotong ikatan fosfodiaeter pada untaian DNA tersebut yakni berupa enzim restriksi.  Enzim restriksi yang diproduksi oleh bakteri dinamakan endonuklease yang secara tipikal mampu mengenali 4 – 8 bp urutan nukleotida yang spesifik. Urutan nukleotida yang spesifik tersebut dinamakan restriction sites yang secara umum merupakan sekuens palindromic (run back) yang pendek dengan pola urutan sekuens yang sama ketika dibaca pada arah  5′ → 3′ (Howe, 2007; Lodish et al., 2003; Ream et al., 2003). Pada Gambar1 ditunjukkan enzim EcoRI yang mampu mengenali enam urutan nukleotida spesifik yang kemudian dipotong menjadi dua. Sementara beberapa contoh enzim restriksi dengan daerah spesifikny disajikan pada Tabel 1.

Gambar 1. Suatu double strand dari DNA yang dipotong oleh enzim restriksi EcoRI (Lodge et al).

Tabel 1. Beberapa contoh endonuklease dengan daerah spesifiknya (Lehninger et al., 2000). 

Enzim restriksi endonuklease dibagi menjadi tiga tipe dengan karakteristik yang berbeda-beda dan disajikan dalam Tabel 2.

Tabel 2. Karakteristik dari masing-masing tipe endonuklease (Howe, 2007; Reece, 2004).

Adapun cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim endonuklease tipe II telah diketahui strukturalnya yang sisi katalitiknya tersusun atas 5 macam protein sekunder dalam bentuk β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam bentuk α-heliks (Gambar 2). Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan ‘scanning’ pada untain molekul DNA jika tidak menemukan restriction sites yang spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding. Mekanisme sliding tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang lekukan DNA.  Namun enzim restriksi endonuklease tersebut akan mengubah konformasinya ketika mengenali daerah restriction sites yang spesifik. Ketika sudah mengenali daerah spesifik, maka enzim tersebut akan memotong dua ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double helix DNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3′ hidroksil (OH) dan gugus 5′ fosfat (PO4-). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai dengan daerah pemotongannya. Enzim endonuklease tidak selamanya memotong DNA menjadi fragmen yang ujungnya simetris (blunt ends), namun ada juga yang ujungnya asimetris (sticky ends) (Gambar 3). Pola potongan simetris  atau tidaknya tergantung kinerja enzim endonuklease seperti yang tertera pada Tabel 1(Allison, 2007; Reece, 2004).

 

Gambar 2. Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau dan biru menunjukkan subunit protein dimer yang identik (Reece).

 Gambar 3. Contoh pola pemotongan enzim restriksi endonuklease. Enzim tersebut menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends (BamHI) dan bentuk simetris atau blunt ends (SmaI) (Allison ).

Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004). Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:

5′ G↓G-A-T-C-C 3′

3′ C-C-T-A-G↑G 5′

Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI berupa formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et al., 1996).

Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens non-spesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).