Bioteknologi ialah pemanfaatan sistem hayati untuk menghasilkan produk barang dan jasa.
- Biologi molekuler menggunakan rekayasa genetik, manipulasi gen untuk tujuan praktis misalnya untuk penelitian dan juga manufaktur ratusan produk yang bermanfaat.
- Praktek-praktek yang didasarkan pada manipulasi DNA in vitro berbeda dari praktek-praktek bioteknologi DNA masa lalu karena karena bioteknologi tersebut memungkinkan dilakukannya modifikasi gen-gen spesifik dan memindahkannya di antara organisme yang sangat berbeda seperti bakteri, tumbuhan, dan hewan (Campbell, 2000).
- Salah satu contoh bioteknologi DNA yaitu DNA plasmid.
- Plasmid merupakan molekul DNA pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri.
- Plasmid dapat mereplikasi DNAnya sendiri terlepas dari DNA pada kromosom.
- Berbagai tipe plasmid telah ditemukan pada sel bakteri.
- Distribusi plasmid pada bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang mengandung plasmid tetapi ada juga yang tidak .
- Pada sel Bakteri Escherichia coly terdapat plasmid F yang menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat konjugatif tertentu.
- Plasmid F bias digunakan sebagai vektor untuk membawa DNA yang akan disisipkan pada genom sel target.(Transformasi)
- Akan tetapi plasmid yang secara rutin digunakan sebagai vektor adalah yang mengandung gen ketahanan terhadap antibiotika (Anonim1).
Fenotipe dari gen ketahanan terhadap antibiotika sangat baik digunakan untuk menseleksi sel-sel yang ditransformasi dengan plasmid tersebut dan juga menseleksi vektornya sendiri yang mengandung DNA rekombinasi.
- Plasmid juga merupakan alat yang efisien untuk mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi yang sangat banyak per selnya (Anonim1).
- DNA plasmid bisa mereplikasi seperti DNA pada inti
Proses penggunaan plasmid bakteri untuk mengklon gen adalah sebagai berikut :
- DNA plasmid diisolasi dari bakteri dan DNA berisi gen yang dinginkan dari jenis sel lain misalnya gen yang mengkode suatu hormon.
- Sepotong DNA yang berisi gen tersebut diselipkan ke dalam salah satu plasmid pada bakteri secara in vitro, yang kemudian menghasilkan DNA rekombinan
- Plasmid rekombinan yang sudah di rekayasa itu dikembalikan ke sel bakteri
- Sel bakteri ditumbuhkan dalam kultur agar sel bakteri membelah , kemudian membentuk klon sel. DNA asing yang disambungkan ke dalam plasmid
- DNA yang disisipkan tidak merusak kemampuan plasmid untuk bereplikasi di dalam sel bakteri'
- Tentu bertujuan agar gen yang diinginkan direplikasi bersama dengan plasmid begitu sel inangnya menjadi banyak. Dapat dikatakan gen itu telah diklon.
- Identifikasi klon bakteri yang membawa gen yang diinginkan tersebut.
- Kesimpulannya Jika DNA yang didisipkan itu misalnya Sequens DNA yang menghasilkan Hormon Insulin maka Klon yang terbentuk akan sama DNA yang disisipkan akan mampu menghasilkan insulin. Sehingga bakteri yang terus membelah dalam junlah banyak bisa mensekresi insulin yang kemudian diekstrak
- Produk insulin ditempatkan pada botol kemudian disuntikan ke penderita DM untuk membantu banyaknya glukosa (gula darah) agar bisa diubah menjadi Glikogen sehingga aman
- Aplikasi terakhir dari pengklonan gen dalam bakteri (Campbell, 2000)
Bioteknologi menggunakan plasmid bakteri untuk mengklon gen
Penggunaan gen dan aplikasinya, mempertimbangkan suatu pendekatan yang menggunakan bakteri dan plasmid bakteri tersebut.
- Plasmid merupakan molekul DNA sirkular kecil yang bereplikasi dari sel bakteri.
- Pada gambar diatas memperlihatkan suatu plasmid gen asing dari sel eukariotik di selipkan di dalamnya dan selanjutnya dikembalikan ke sel bakteri.
- Bakteri mereplikasi DNA rekombinannya. Pada keadaan yang dikocok, klon bakteri akan membuat protein yang dikode oleh gen asing tersebut (Campbell, 2000).
- Pertama untuk menghasilkan produk protein baik untuk dipelajari maupun untuk tujuan praktis.
- Misalnya penggunaan bakteri untuk membawa gen hormon pertumbuhan manusia untuk mengatasi masalah pertumbuhan yang terhambat.
- Kedua untuk mempersiapkan banyak salinan dari gen itu sendiri.
- Kemungkinan peneliti dapat menentukan urutan nukleotida gen atau menggunakan gen itu untuk member suatu organism kemampuan metabolik baru(Campbell, 2000).
Dalam proses pengklonan gen dengan memanfaatkan DNA plasmid sebagai vektor klon tidak terlepas dari peranan enzim, dalam hal ini enzim restriksi dan ligase.
- Enzim restriksi (endonuklease Restriksi) yaitu enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas
- Enzim Ligase yang menyatukan potongan sequen DNA menjadi satu sehingga bisa disisipkan
- Dan enzim enzim itu dipelajari ketika terjadi penyerangan virus Litik ke banteri dalam replikasinya menyerang inang .
- Di alam, enzim ini melindungi bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain, seperti virus atau sel bakteri lain.
- Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA asing, suatu proses yang disebut restriksi (Campbell, 2000).
- Sel bakteri melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metal (-CH3) pada adenine atau sitosin di dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi tersebut (Campbell, 2000).
Penggunaan enzim restriksi dan DNA ligase untuk membuat DNA rekombinan.
Dengan enzim restriksi dan DNA ligase maka plasmid rekombinan dapat dibuat.
- Plasmid aslinya disebut vektor pengklon didefinisikan sebagai molekul DNA yang dapat membawa DNA asing ke dalam sel dan bereplikasi di dalam sel tersebut. plasmid bakteri banyak digunakan sebagai vektor pengklon (Campbell, 2000).
- Plasmid rekombinan dihasilkan melalui penyambungan fragmen restriksi dari DNA asing ke dalam plasmid yang diisolasi dari bakteri dapat dikembalikan secara relatif mudah ke bakterinya.
- Ketika bakteri bereproduksi, plasmid ini bereplikasi di dalamnya.
- Klon sel yang dihasilkan tampak sebagai koloni pada medium padat, berisi banyak salinan suatu klon dari DNA asing tersebut (Campbell, 2000).
Bakteri merupakan sel yang paling umum digunakan untuk pengklonan gen, terutama karena mudahnya DNA dapat diisolasi dari dan dimasukan kembali ke dalam sel tersebut.
1. Pengisolasian vektor dan sumber-sumber gen.
- Proses ini diawali dengan mempersiapkan dua jenis DNA yaitu plasmid bakteri dan DNA yang mengandung gen yang diinginkan.
- DNA yang terakhir diambil dari misalnya sel jaringan manusia yang telah ditumbuhkan dalam kultur laboratorium.
- Plasmid dapat diambil dariE.coli dan membawa dua gen yang bermanfaat dalam memberikan resistensi terhadap antibiotik ampisilin dan hidrolisis gula laktosa.
- Plasmid ini memiliki urutan pengenalan tunggal untuk enzim restriksi yang digunakan yang terletak di dalam gen lacZ.
- Enzim memotong DNA plasmid pada tempat restriksi tunggalnya, mengganggu gen lacZ.
- Enzim ini juga memotong DNA manusia, menghasilkan ribuan fragmen, salah satu fragmen membawa gen yang diinginkan.
- Enzim menciptakan ujung lengket pada fragmen DNA manusia dan plasmid. Enzim DNA ligase menggabungkan molekul-molekul DNA melalui ikatan kovalen.
- Hasilnya ialah molekul DNA rekombinan.
- Sel bakteri mengambil plasmid rekombinan melalui transformasi (penyerapan DNA telanjang dari larutan sekeliling : lihat video terlampir).
- Bakteri berupa lacZ–tidak dapat menghidrolisis laktosa.
- Sebagian bakteri ini memperoleh DNA plasmid rekombinan yang diinginkan; banyak sel lain mengambil DNA lain, baik rekombinan maupun non-rekombinan.
- Pengklonan sel-sel (dan gen asing).
- Bakteri ditempatkan pada nutrient agar.
- Gen plasmid dimanfaatkan untuk memilih koloni sel yang membawa plasmid rekombinan.
- Identifikasi klon sel yang membawa gen yang diinginkan.
- Metode untuk mendeteksi DNA suatu gen secara langsung tergantung pada pembuatan pasangan-basa antara gen dan urutan komplementer pada molekul asam nukleat lain, disebut hibridisasi asam nukleat.
- Molekul komplementer, asam nukleat untai tunggal pendek yang dapat berupa RNA atau DNA, disebut probe asam nukleat.
- Denaturasi sel dilakukan untuk pemisahan kedua untai DNA.
- Gen hasil klon dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen yang serupa atau identik di dalam DNA sumber lain.
- Jika sel mengandung gen diinginkan mentranslasi gen tersebut menjadi protein, maka identifikasi gen yang diinginkan dapat dilakukan dengan cara menyaring semua klon berdasarkan keberadaan protein tersebut (Campbell, 2000).
Salah satu contoh penerapan DNA plasmid dalam kehidupan yaitu di bidang pertanian dengan memanfaatkan plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefacines
- Bakteri Agrobacterium tumefasiens yang secara alami dapat menginfeksi tumbuhan dan menyebabkan tumor yang disebut empedu mahkota.
- Tumor ini dimasukkan oleh plasmid Ti (Tumor inducing/ Penginduksi tumor).
- Plasmid Ti ini mengintergrasikan segmen DNA-nya, yang dikenal sebagai DNA T, ke dalam DNA kromosom sel tumbuhan inangnya (Campbell 2000).
- Gen asing dapat diselipkan ke dalam plasmid Ti dengan menggunakan teknik DNA rekombinan.
- Plasmid rekombinannya dikembalikan ke Agrobacterium yang kemudian dapat digunakan untuk menginfeksi sel tumbuhan yang ditumbuhkan di dalam kultur atau dimasukkan langsung ke dalam sel tumbuhan, dimana plasmid tersebut akan menyelipkan dirinya sendiri ke dalam kromosom tumbuhan tersebut (Campbell 2000).
Dengan memanfaatkan sel-sel tersebut akan meregenerasi keseluruhan tanaman, hal ini memungkinkan untuk menghasilkan tumbuhan yang mengandung dan mengekspresikan gen asing dan yang mewariskannya pada turunannya (Campbell 2000).
Ti plasmid pada Agrobacterium yang akan dipindahkan ke dalam sel tumbuhan.
Penggunaan plasmid Ti sebagai vektor untuk rekayasa genetik pada
- Kelemahan utama penggunaan plasmid Ti sebagai vektor ialah bahwa hanya tumbuhan dikotil saja yang rentan terhadap infeksi Agrobacterium.
- Tumbuhan monokotil yang juga penting bagi bidang pertanian tidak dapat diinfeksi oleh Agrobacterium.
- Untungnya para saintis dapat menggunakan teknik baru seperti elektroporasi dan tembakan DNA untuk memasukkan DNA ke dalam sel tumbuhan ini (Campbel, 2000).
Sumber :
Campbell, Neil. A., Jane B. Reece, Lawrence G. Mitchell. 2000.Biologi. Edisi Kelima. Jilid 1. Erlangga, Jakarta.
