KLONING DNA

Mekanisme:

1. Mengambil gen atau bagian dari gen yang diinginkan dari 1 organisme (donor).
2. Insersi gen yang diinginkan ke vektor (plasmid, virus, cosmid)
3. Memasukkan vektor yang telah mengandung insert DNA ke sel hospes yang sesuai (cloning host), baik bakteri, jamur, ataupun sel mamalia.
4. Seleksi sel host yang berisi DNA yang diinginkan.
5. Konfirmasi dengan analisis DNA/protein.

• Produknya macam-macam, bisa untuk memproduksi protein, menghasilkan tanaman transgenik bebas hama misalnya, ataupun sumber pembelajaran DNA.
• Sebagai tambahan, makhluk bernama E. coli ini teryata merupakan sel host dalam kloning yang paling digunakan secara massive untuk amplifikasi rekombinasi DNA.
  
• Selain itu, suatu penelitian menghasilkan pisang transgenik hasil klon DNA hepatitis yang dapat menginduksi imunitas terhadap hepatitis yang tadinya diinsersi ke suatu vektor, mis. plasmid.
  
• Pisang yang dihasilkan, jika dikonsumsi, dapat berperan sebagai vaksin hepatitis pada manusia.

Sejarah

• Awal tahun 70an, Herbert Boyer, Stanley Cohen, Paul Berg dan co-workers memulai teknologi rekombinasi DNA dengan menyisipkan beberapa bagian DNA asing ke dalam sel host
  
• Kemudian DNA rekombinan itu diklon ke sel host , agar memproduksi kopi dari DNA yang disisipkan sebanyak mungkin.

Prisip dasar teknik, yaitu

• Dengan menyisipkan DNA dari satu spesies (donor) ke spesies lain (resipien).
• Sel resipien kemudian akan bereplikasi, lalu memproduksi banyak kopi dari DNA rekombinan yang baru.
  
• Organisme yang mengandung fragmen DNA asing yang sengaja dibuat inilah yang disebut sebagai transgenik.

Sifat-Sifat Penting Vektor untuk Kloning Gen

• Punya oriC (origin of replication) supaya dapat berplikasi memperbanyak DNA.
  
• Plasmid adalah materi genetik yang dapat bereplikasi secara mandiri.
• Dapat menerima DNA insert, kecil, dan tidak mudah terdegradasi.
• Mempunyai situs restriksi yang dapat digunakan untuk insersi/penyisipan gen yang akan diklon.
• Membawa gen marker, misalnya membawa sifat resistensi antibiotika  digunakan untuk seleksi.
  
• Misalnya kita ingin melakukan kloning DNA ke plasmid pada sel bakteri.
  

Bagaimana cara menyeleksi bakteri mana yang mengndung plasmid rekombinan tersebut?

• Caranya, diinsersi pula gen penyandi resistensi ampicilin dan tetracyclin.
  
• Kemudian, mediumnya diberi kedua antiobiotik tersebut.
  
• Bakteri yang dapat tumbuh pada media tersebut yang mengandung gen yang disisipkan.
  
• Tapi, harus dibuktikan lebih lanjut.

• Selain sifat-sifat di atas, khusus untuk kloning yang bertujuan untuk ekspresi protein, sifat tambahannya adalah mempunyai promoter, untuk transkripsi dan ribosome binding sequence untuk translasi sebagai bagian dari ekspresi gen pada prokaryot, sedangkan pada mamalia memiliki fragment Kozak.

Jenis-Jenis Vektor

Vektor yang digunakan untuk kloning gen antara lain:

• Retrovirus
• Adenovirus
• Adeno-associated virus (AAV)
• Herpes simplex virus
• Rhinoviruses
• Human Immunodeficiency Virus (HIV)
• Plasmid of various types. Ex: plasmid pBR322 dan pUC; maksimal hingga 20 kb.
• Faga lambda
• Kosmid (hibrid plasmid dan faga lambda); maksimal sampai 50 kb.

Introduksi klon gen ke sel hospes

• Sel hospes: Bakteri, sel mamalia, serangga, tanaman
• Syaratnya: tumbuh cepat, non-patogen, genomnya sudah dipetakan, dapat menerima vektor plasmid atau faga, mempertahankan gen asing selama multiplikasinya, serta mengekspresi dan mensekresi protein klon dalam jumlah besar.

Metode

1. Transformasi
2. Transfeksi
3. Elektroporasi
4. Biolistik
5. Transduksi
6. Mikroinjeksi

1.Transformasi

• DNA diambil langsung dari medium dan direkombinasikan ke genom sel kompeten, yaitu sel bakteri yang bisa mengambil DNA.
  
• DNA rekombinan diinsersi ke DNA sirkuler untai ganda pada salah satu untai saja (misalnya di luar), membentuk heteroduplex karena untai di dalam tidak mengalami rekombinasi.
  
• Kedua untai mengalami replikasi, sehingga bakteri yang dihasilkan ada yang mengandung gen insersi adapula yang tidak.

2.Transfeksi

• Prosesnya dilakukan dengan memperkenalkan materi asing pada sel eukariotik.
  
• Transfeksi melibatkan pembukaan pori di membran plasma, sehingga materialnya bisa diambil.
  
• Materi genetik seperti supercoiled plasmid DNA dan siRNA, bahkan protein antibodi dapat ditransfeksikan.
  
• Metode ini sering diikuti dengan mencampur lipid kationik dengan material tertentu untuk memproduksi liposom yang akan berfusi ke membran plasma dan mendeposito isinya di dalam.
  
• Transfeksi sering digunakan untuk transfeksi yang berkaitan degnan sel mamalia, sedangkan pada bakteri dan terkadang, tumbuhan, jenis proses ini disebut transformasi.

• Disebut juga transformasi untuk proses yang terjadi di bakteri dan tumbuhan.
  
• HeBS (HEPES buffered saline solution) yang mengandung ion fosfat dikombinasikan dengan larutan kalsium klorida yang mengandung DNA.
  
• Ketika keduanya digabungkan, presipitat dari kalsium fosfat akan terbentuk dan akan mengikat DNA untuk ditransfeksikan.
  
• Suspensi dari presipitat ini kemudian ditambahkan ke dalam sel untuk ditransfeksikan (biasanya berupa kultur yang tumbuh di lapisan tunggal).
  
• Lalu, dengan suatu proses yang belum diketahui, sel akan mengambil beberapa presipitat, sehingga kandungan DNA di dalamnya turut masuk.
  
• Caranya: elektroporasi, heat shock, lipofectamin dan fugene, serta senjata gen (DNA dipasangkan dengan partikel nano dari solid inert (emas), kemudian ditembakkan ke nukleus sel target.

3.Elektroporasi

• Untuk host yang punya dinding sel, digunakan enzim untuk mencerna dinding sel, menyisakan protoplasma.
  
• DNA asing dimasukkan melalui kanal yang terbuka akibat tegangan listrik yang diekspose ke protoplast.
  
• Sel yang udah ditransformasikan lalu dikultur dan dimedia yang menginduksi pembentukan dinding sel dan pertumbuhan menjadi organisme utuh. Sel hewan gampang karena tidak memiliki dinding sel.

4.Biolistik

• Dibombardir dengan proyektil mikroskopis (terbuat dari substansi inert, seperti emas) dan diselubungi DNA.
  
• Ditembakkan pada kecepatan tinggi ke dalam sel atau jaringan.
  
• Teknik ini menjanjikan untuk digunakan pada organisme yang masih hidup.

5.Transduksi

• Melalui infeksi virus dengan afinitas tertentu untuk tipe sel tertentu, sehingga dapat digunakan sebagai vektor jika diisi oleh DNA asing.

6.Mikroinjeksi

• Tujuannya untuk memperbaiki genetik disorder, supaya sel yang DNA nya mengalami kelainan bisa berubah dan mensubtitusi gen yang fungsional.
  
• Contohnya untuk menghasilkan hewan transgenik, DNA diinsersi ke zigot atau embryo awal dengan injeksi menggunakan pipet kecil/halus.
  
• Zigot/embrio yang sudah ditransformasikan lalu diimplantasi ke rahim ibu untuk pertumbuhan dan perkembangan.

Seleksi klon yang mengandung insert DNA yang dikehendaki

• Sel bakteri : Ampicilin
• Sel mamalia : Geniticin

• DNA library berisi koleksi fragment klon terbatas yang berasal dari genom suatu organisme. Tujuannya untuk memiliki semacam database.
• Genomic library adalah perpus yang isinya genom komplit, dalam bentuk fragment kecil DNA (oligonukleotida) yang merepresentasikan gen yang telah diketahui.
• Bioinformatika cabang ilmu yang mengaplikasikan penggunaan komputer dalam analisa data genetik.
• cDNA library adalah perpus yang berisikan cDNA yang direkonstruksi dengan reverse transkriptase dari beberapa mRNA organisme.

Konfirmasi Klon

Untuk mengkonfirmasi klon dapat dilakukan:

• Pemotongan dengan restriksi endonuklease
• Southern blot
• PCR

Western blot protein

Langkah-langkahnya

1. Protein dengan komposisi yang berbeda-beda, dielektroforesis pada gel poliakrilamida. Hasilnya berupa pemisahan molekul protein berdasarkan ukurannya.
   
2. Blot protein/gel ke membran nitroselulosa.
3. Adanya protein tertentu akan dikenali dengan antibodi spesifik. Antibodi sekunder berlabel radioaktif atau enzim.
   
4. Kemudian dilakukan visualisasi.

Analis Ekspresi Protein dengan DNA mikroarray

Contoh:

• Untuk mengetahui perbedaan ekspresi gen pada sel kanker dan sel normal
• Pada chip, direkatkan sejumlah probe oligonukleotida yang mengenali gen-gen yang akan diteliti.
  
• Sementara itu, dilakukan isolasi mRNA  dengan enzim reverse transkriptase, dibuat cDNA
  
• Dibuat pula label yang berbeda untuk sel kanker (merah) dan sel normal (hijau) 
• Campurkan cDNA, hibridisasikan pada chip microarray yang telah disiapkan
  
• Baca hasilnya.

Mutagenesis dengan oligonukleotida sintetik

• DNA bakteri yang sirkuler dan beruntai ganda, terkadang ketika bereplikasi mengalami mutasi DNA.
  
• Misalnya basa G yang berpasangan dengan T (seharusnya yang berpasangan dengan T adalah basa C)
• Ketika bereplikasi, terbentuk 2 DNA sirkuler yang mengandung mutan replikasi semakin sering.
  
• Hasilnya, terdapat DNA sirkuler yang mengandung mutan, ada pula yang tidak.