KLONING DNA

Mekanisme:

1. Mengambil gen atau bagian dari gen yang diinginkan dari 1 organisme (donor).
2. Insersi gen yang diinginkan ke vektor (plasmid, virus, cosmid)
3. Memasukkan vektor yang telah mengandung insert DNA ke sel hospes yang sesuai (cloning host), baik bakteri, jamur, ataupun sel mamalia.
4. Seleksi sel host yang berisi DNA yang diinginkan.
5. Konfirmasi dengan analisis DNA/protein.

• Produknya macam-macam, bisa untuk memproduksi protein, menghasilkan tanaman transgenik bebas hama misalnya, ataupun sumber pembelajaran DNA.
• Sebagai tambahan, makhluk bernama E. coli ini teryata merupakan sel host dalam kloning yang paling digunakan secara massive untuk amplifikasi rekombinasi DNA.
  
• Selain itu, suatu penelitian menghasilkan pisang transgenik hasil klon DNA hepatitis yang dapat menginduksi imunitas terhadap hepatitis yang tadinya diinsersi ke suatu vektor, mis. plasmid.
  
• Pisang yang dihasilkan, jika dikonsumsi, dapat berperan sebagai vaksin hepatitis pada manusia.

Sejarah

• Awal tahun 70an, Herbert Boyer, Stanley Cohen, Paul Berg dan co-workers memulai teknologi rekombinasi DNA dengan menyisipkan beberapa bagian DNA asing ke dalam sel host
  
• Kemudian DNA rekombinan itu diklon ke sel host , agar memproduksi kopi dari DNA yang disisipkan sebanyak mungkin.

Prisip dasar teknik, yaitu

• Dengan menyisipkan DNA dari satu spesies (donor) ke spesies lain (resipien).
• Sel resipien kemudian akan bereplikasi, lalu memproduksi banyak kopi dari DNA rekombinan yang baru.
  
• Organisme yang mengandung fragmen DNA asing yang sengaja dibuat inilah yang disebut sebagai transgenik.

Sifat-Sifat Penting Vektor untuk Kloning Gen

• Punya oriC (origin of replication) supaya dapat berplikasi memperbanyak DNA.
  
• Plasmid adalah materi genetik yang dapat bereplikasi secara mandiri.
• Dapat menerima DNA insert, kecil, dan tidak mudah terdegradasi.
• Mempunyai situs restriksi yang dapat digunakan untuk insersi/penyisipan gen yang akan diklon.
• Membawa gen marker, misalnya membawa sifat resistensi antibiotika  digunakan untuk seleksi.
  
• Misalnya kita ingin melakukan kloning DNA ke plasmid pada sel bakteri.
  

Bagaimana cara menyeleksi bakteri mana yang mengndung plasmid rekombinan tersebut?

• Caranya, diinsersi pula gen penyandi resistensi ampicilin dan tetracyclin.
  
• Kemudian, mediumnya diberi kedua antiobiotik tersebut.
  
• Bakteri yang dapat tumbuh pada media tersebut yang mengandung gen yang disisipkan.
  
• Tapi, harus dibuktikan lebih lanjut.

• Selain sifat-sifat di atas, khusus untuk kloning yang bertujuan untuk ekspresi protein, sifat tambahannya adalah mempunyai promoter, untuk transkripsi dan ribosome binding sequence untuk translasi sebagai bagian dari ekspresi gen pada prokaryot, sedangkan pada mamalia memiliki fragment Kozak.

Jenis-Jenis Vektor

Vektor yang digunakan untuk kloning gen antara lain:

• Retrovirus
• Adenovirus
• Adeno-associated virus (AAV)
• Herpes simplex virus
• Rhinoviruses
• Human Immunodeficiency Virus (HIV)
• Plasmid of various types. Ex: plasmid pBR322 dan pUC; maksimal hingga 20 kb.
• Faga lambda
• Kosmid (hibrid plasmid dan faga lambda); maksimal sampai 50 kb.

Introduksi klon gen ke sel hospes

• Sel hospes: Bakteri, sel mamalia, serangga, tanaman
• Syaratnya: tumbuh cepat, non-patogen, genomnya sudah dipetakan, dapat menerima vektor plasmid atau faga, mempertahankan gen asing selama multiplikasinya, serta mengekspresi dan mensekresi protein klon dalam jumlah besar.

Metode

1. Transformasi
2. Transfeksi
3. Elektroporasi
4. Biolistik
5. Transduksi
6. Mikroinjeksi

1.Transformasi

• DNA diambil langsung dari medium dan direkombinasikan ke genom sel kompeten, yaitu sel bakteri yang bisa mengambil DNA.
  
• DNA rekombinan diinsersi ke DNA sirkuler untai ganda pada salah satu untai saja (misalnya di luar), membentuk heteroduplex karena untai di dalam tidak mengalami rekombinasi.
  
• Kedua untai mengalami replikasi, sehingga bakteri yang dihasilkan ada yang mengandung gen insersi adapula yang tidak.

2.Transfeksi

• Prosesnya dilakukan dengan memperkenalkan materi asing pada sel eukariotik.
  
• Transfeksi melibatkan pembukaan pori di membran plasma, sehingga materialnya bisa diambil.
  
• Materi genetik seperti supercoiled plasmid DNA dan siRNA, bahkan protein antibodi dapat ditransfeksikan.
  
• Metode ini sering diikuti dengan mencampur lipid kationik dengan material tertentu untuk memproduksi liposom yang akan berfusi ke membran plasma dan mendeposito isinya di dalam.
  
• Transfeksi sering digunakan untuk transfeksi yang berkaitan degnan sel mamalia, sedangkan pada bakteri dan terkadang, tumbuhan, jenis proses ini disebut transformasi.

• Disebut juga transformasi untuk proses yang terjadi di bakteri dan tumbuhan.
  
• HeBS (HEPES buffered saline solution) yang mengandung ion fosfat dikombinasikan dengan larutan kalsium klorida yang mengandung DNA.
  
• Ketika keduanya digabungkan, presipitat dari kalsium fosfat akan terbentuk dan akan mengikat DNA untuk ditransfeksikan.
  
• Suspensi dari presipitat ini kemudian ditambahkan ke dalam sel untuk ditransfeksikan (biasanya berupa kultur yang tumbuh di lapisan tunggal).
  
• Lalu, dengan suatu proses yang belum diketahui, sel akan mengambil beberapa presipitat, sehingga kandungan DNA di dalamnya turut masuk.
  
• Caranya: elektroporasi, heat shock, lipofectamin dan fugene, serta senjata gen (DNA dipasangkan dengan partikel nano dari solid inert (emas), kemudian ditembakkan ke nukleus sel target.

3.Elektroporasi

• Untuk host yang punya dinding sel, digunakan enzim untuk mencerna dinding sel, menyisakan protoplasma.
  
• DNA asing dimasukkan melalui kanal yang terbuka akibat tegangan listrik yang diekspose ke protoplast.
  
• Sel yang udah ditransformasikan lalu dikultur dan dimedia yang menginduksi pembentukan dinding sel dan pertumbuhan menjadi organisme utuh. Sel hewan gampang karena tidak memiliki dinding sel.

4.Biolistik

• Dibombardir dengan proyektil mikroskopis (terbuat dari substansi inert, seperti emas) dan diselubungi DNA.
  
• Ditembakkan pada kecepatan tinggi ke dalam sel atau jaringan.
  
• Teknik ini menjanjikan untuk digunakan pada organisme yang masih hidup.

5.Transduksi

• Melalui infeksi virus dengan afinitas tertentu untuk tipe sel tertentu, sehingga dapat digunakan sebagai vektor jika diisi oleh DNA asing.

6.Mikroinjeksi

• Tujuannya untuk memperbaiki genetik disorder, supaya sel yang DNA nya mengalami kelainan bisa berubah dan mensubtitusi gen yang fungsional.
  
• Contohnya untuk menghasilkan hewan transgenik, DNA diinsersi ke zigot atau embryo awal dengan injeksi menggunakan pipet kecil/halus.
  
• Zigot/embrio yang sudah ditransformasikan lalu diimplantasi ke rahim ibu untuk pertumbuhan dan perkembangan.

Seleksi klon yang mengandung insert DNA yang dikehendaki

• Sel bakteri : Ampicilin
• Sel mamalia : Geniticin

• DNA library berisi koleksi fragment klon terbatas yang berasal dari genom suatu organisme. Tujuannya untuk memiliki semacam database.
• Genomic library adalah perpus yang isinya genom komplit, dalam bentuk fragment kecil DNA (oligonukleotida) yang merepresentasikan gen yang telah diketahui.
• Bioinformatika cabang ilmu yang mengaplikasikan penggunaan komputer dalam analisa data genetik.
• cDNA library adalah perpus yang berisikan cDNA yang direkonstruksi dengan reverse transkriptase dari beberapa mRNA organisme.

Konfirmasi Klon

Untuk mengkonfirmasi klon dapat dilakukan:

• Pemotongan dengan restriksi endonuklease
• Southern blot
• PCR

Western blot protein

Langkah-langkahnya

1. Protein dengan komposisi yang berbeda-beda, dielektroforesis pada gel poliakrilamida. Hasilnya berupa pemisahan molekul protein berdasarkan ukurannya.
   
2. Blot protein/gel ke membran nitroselulosa.
3. Adanya protein tertentu akan dikenali dengan antibodi spesifik. Antibodi sekunder berlabel radioaktif atau enzim.
   
4. Kemudian dilakukan visualisasi.

Analis Ekspresi Protein dengan DNA mikroarray

Contoh:

• Untuk mengetahui perbedaan ekspresi gen pada sel kanker dan sel normal
• Pada chip, direkatkan sejumlah probe oligonukleotida yang mengenali gen-gen yang akan diteliti.
  
• Sementara itu, dilakukan isolasi mRNA  dengan enzim reverse transkriptase, dibuat cDNA
  
• Dibuat pula label yang berbeda untuk sel kanker (merah) dan sel normal (hijau) 
• Campurkan cDNA, hibridisasikan pada chip microarray yang telah disiapkan
  
• Baca hasilnya.

Mutagenesis dengan oligonukleotida sintetik

• DNA bakteri yang sirkuler dan beruntai ganda, terkadang ketika bereplikasi mengalami mutasi DNA.
  
• Misalnya basa G yang berpasangan dengan T (seharusnya yang berpasangan dengan T adalah basa C)
• Ketika bereplikasi, terbentuk 2 DNA sirkuler yang mengandung mutan replikasi semakin sering.
  
• Hasilnya, terdapat DNA sirkuler yang mengandung mutan, ada pula yang tidak.

REKAYASA GENETIKA 1

Defenisi

• Rekayasa genetik adalah manipulasi DNA dengan menggunakan teknik DNA rekombinan.
• Teknik DNA rekombinan: DNA dipotong kemudian dipisahkan berdasarkan ukuran setelah itu disekuensing untuk menentukan komposisi dan urutan nukleotidanya. OK

Tujuan

1. Isolasi gen tertentu, bagian dari gen atau daerah genomnya.
2. Menghasilkan RNA atau molekul protein yang diinginkan dalam jumlah banyak
3. Meningkatkan efisiensi dalam pembuatan enzim dan obat-obatan secara komersil
4. Memodifikasi organisme, sehingga dapat mengekspresikan suatu sifat baru yang sebelumnya tidak dikode oleh gen.
5. Koreksi kelainan genetik di organisme, termasuk manusia.

Peralatan

• Peralatannya meliputi Polmerase Chain Reaction (PCR)
• PCR digunakan untuk memperbanyak DNA supaya dapat dianalisis, elektroforesis, etc.

Teknik Rekayasa Genetik

Struktur DNA

• DNA merupakan polimer dari nukleotida yang terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa Nitrogen. Gula deoksiribosa terbentuk karena atom C no.2 pada gula ribosa kehilangan oksigen.
• Basa N terdiri dari purin (adenin & guanin) dan pirimidin (cytosin & timin).
• Basa N membentuk ikatan hidrogen dengan komplementernya, A x T dan G x C à membentuk untai nukleotida yang anti paralel.
• Untai pertama tersusun oleh nukleotida dari arah 3’ ke 5’, sedangkan pasangannya terususun dari arah 5’ ke 3’.
• Struktur inilah yang membentuk double helix pada DNA.
• Replikasi Semikonservatif merupakan proses replikasi DNA yang menunjukkan kemampuan penurunan sifat yang merupakan gabungan rantai DNA parenatal dan baru yang dibentuk

Proses replikasi

• Secara in vivo, terjadi replikasi dari arah 5’ ke 3’.
• Terbentuk dua untai yang disebut leading strand dan lagging strand.
• Lagging strand, untainya direplikasi terputus-putus, membentuk fragmen yang disebut fragment okazaki.

• BP membant fiksasi untai DNA template yang telah terbuka untuk mencegah kedua untai bersatu kembali.\
• Oleh karena itu, prinsip replikasi selalu diawali dengan membuka rantai DNA sense sehingga terpisah dengan rantai anti sense DNA.
• Prinsip ini dapat diterapkan dalam denaturasi DNA secara in vitro.
• Adonannya: DNA sbg template, topoisomerase, DNA polimerase III, etc.
• DNA terdenaturasi melalui pemanasan, memerlukan suhu yang sangat tinggi, 90-950 C.

Enzim Restriksi Endonuklease

• Enzim dapat memotong DNA pada untai tertentu, memotong ikatan fosfodiester kedua untai.
• Tempat pemotongannya (restriction site) dinamakan palindrom
• Prinsipnya seperti cermin, di mana untai 3’ ke 5’ menjadi cermin 5’ ke 3’.
• Ex: Pada untai 3’ ke 5’ terbentuk urutan G A A T T C, maka cerminnya adalah kebalikan dari urutan basa N tersebut, C T T A A G.
• DNA yang kepotong bisa jadi berekor(sticky end) atau berujung rata (blunt end).
• Untuk yang ujung rata kodenya CCCGGG yg berpasangan dengan GGGCCC.

• Kalo ekor, dipotong di urutan nukleotida G AATTC. Yang berekor ini lebih baik digunakan karena ia membentuk lock and key dengan tempat pemotongan pada vektor, misalnya plasmid bakteri.
• Potongan DNA ini disebut fragment restriksi.
• Bakteri memiliki kromosomal (mencapai Mega bp) dan ekstrakromosomal (k bp) yang disebut plasmid.
• Plasmid biasa digunakan untuk kloning karena dapat bereplikasi secara mandiri, dan banyak mengandung restriction site.

 

Bagaimana melakukan kloning DNA ke plasmid?

1. diperlukan enzim Endonuklease restriksi dan
2. Enzim ligase.

Enzim Ligase

• Ligase adalah enzim yang menautkan 2 fragmen DNA dengan menyambung ikatan gula- fosfat yang terpotong endonuklease.
• Misalnya, insert (DNA yang akan diklon) memiliki situs potongan untuk Enzim EcoR1, vektor DNA (plasmid) juga harus punya à samakan, kemudian dipotong à membentuk sticky end.
• Dengan bantuan ligase, keduanya akan menyambung, dan terbentuk molekul rekombinan.
• Suatu plasmid memiliki situs pemotongan untuk enzim Alu I dan Hind III.
• Dipilih enzim yang memotong sesuai keinginan, jangan sampai motong di sembarang tempat.
• Tidak ketemu trus bagaimana ?
• Direkayasakan dengan PCR
• Caranya daerah tersebut diamplifikasi, primernya disisipi dengan daerah yang bisa dikenali, sehingga amplifikasi bisa dilakukan dengan enzim yang tadinya tidak bisa digunakan.

• Tidak semua mikroorganisme memiliki DNA, ada virus yang materi genetiknya RNA.
• Dalam kloning, kita akan menggunakan materi genetik yang berupa DNA.
• Bagaimana dengan virus RNA?
• ada Enzim Reverse Transkriptase

Enzim Reverse Transkriptase

• Digunakan reverse transkiptase. Enzim ini bertolakbelakang dengan dogma sentral: DNA àRNA à protein.
• Dahulu, orang berpikir, enzim tidak bisa balik.
• Tidak bisa menjadi RNA lagi karena mengalami processing, sehingga gen manusia jika diamplifikasi akan sukar karena memiliki ekson dan intron yang tidak mengkode gen.
• Klon DNA yang gennya dibatasi oleh intron, jika dimasukkan ke dalam PCR, daerah intronnya yang tidak dibutuhkan akan ikut teramplifikasi.
• RNA ternyata dapat diranskripsi balik menjadi DNA. Dengan reverse dari RNA yang hanya mengandung exon (intronnya telah dibuang melalui splicing) à diperoleh DNA.
• Caranya terus bagaimana ?
• Template berupa RNA yang memiliki ekor yang kaya akan polinukleotida A (AAAA) di ujung 3’. DNA primer berisi oligo dT (TTTT) akan berikatan dengan ekor RNA sebagai pasangan poli A, lalu dielongasi dari arah 5’ ke 3’ dengan reverse transkriptase.
• Terbentulah cDNA, komplementernya.
• Setelah selesai, cDNA akan menjadi template untuk replikasi pasangannya à terbentuklah cDNA untai ganda à diperbanyak dengan PCR, lalu dipotong dengan retriksi endonuklease à diklon.

Bagaimana kita mengetahui klon telah berhasil atau tidak?

• Genome dan Analisis Protein
• Untuk mengetahui keberhasilan kloning, digunakan jel elektroforesis
• Penggunaan elektroforesis dengan menggunakan jel agarosa atau poliakrimilamida.
• Di agar, lalu dibuat cetakannya, kemudian diberkukan à cetakan sumur diberikan DNA hasil amplifikasi.
• DNA bermuatan negatif karena gugus fosfat à DNA akan berjalan ke kutub positif.
• Hasilnya berupa separasi DNA berdasarkan berat molekulnya.
• DNA juga akan terpisah sesuai berat molekulnya.

• Misalnya 500 kb akan berbeda dengan 300 kb.
• Yang paling jauh adalah 300 karena lebih kecil, sehingga lebih mudah melewati pori-pori.

• Pengecekan dapat menggunakan marker.
• Jika 300 yang kita amplifikasi, garis visualisasi yang terbentuk pada agar akan berada di sekitar daerah 300 pada marker.
• Marker adalah DNA yang dipotong-potong pada daerah tertentu yang berfungsi seperti skala dengan ukuran tertentu.

• Ex: Hasil elektroforesis DNA Lambda yang dipotong pake EcoRI.
• DI sini bisa dilihat, ada berbagi macam ukuran dari potongan EcoRI.
• Setelah dielektroforesis, DNA yg terdiri dari 21.2 kb (paling gede) akan berada paling jauh dari kutub positif dan garisnya kelihatan tebal. Klo yg 3,6 kb paling dekat ke kutub positif.
• Menunjukkan semakin kecil BM semakin cepat migrasinya ke kutub yg berlawanan.
• Yg gede, yah harus jalan lambat karena kegedean. Meskipun kesannya the biggest loser, to be honest, big means beautiful! :D

Hibridasi Asam Nukleat dan Pelacak (Probe)

• Produk yang diinginkan bisa dideteksi atau dilacak denga probe.
• DNA ketika didenaturasi akan menjadi ssDNA, jika didinginkan akan terjadi renaturasi menjadi dsDNA.
• Dua untai asam nukleat dengan urutan basa yang saling berkomplementer, dapat bergabung satu sama lain. Gabungan ini dapat berupa DNA-DNA, DNA- RNA, dan RNA-RNA. Sifat ini digunakan untuk merancang oligonukleotida yang mengenali fragmen/sekuens DNA tertentu yang ingin dicari dengan pelacak/probe. Supaya bisa dilihat, probenya dilabel dengan radioaktif atau enzim. Teknik mendeteksi asam nukleat tertentu dengan probe RNA atau DNA inilah yang disebut hibridisasi.
• Radioaktif maupun enzim memiliki manfaat dan mudarat (kerugian) masing- masing. Radioaktif memiliki sensitifitas yang tinggi, apalagi pada DNA yang berukuran kecil, tetapi dapat berpotensi memancarkan radiasi, seperti neutron yag dapat masuk ke dalam kulit dan mematahkan DNA yang menyandi sel epidermis. Akibatnya, kulit terbuka, sehingga harus dirawat di ruang steril.
• Penggunaan Enzim kurang sensitif, tetapi resikonya jauh lebih kecil dibanding radioaktif, sehingga tidak diperlukan peralatan mahal seperti antiradioaktif.

Penggunaan Mekanisme Blot

• Mekanisme blot: Sampel dilarikan pada elektroforesis jel agarosa à blot ke membran à hibridisasi dengan pelacak berlabel àvisualisasi.
• Terdapat Southern Blot untuk sampel DNA dan Northern blot untuk sampel RNA.
• Di samping itu, adapula hibridasisi balik tanpa label radioaktif.
• Hasilnya nanti dianalisis.

• Hasil analisis dapat dihasilkan gambar yang menyerupai titik2 hitam yang banyak, digunakan untuk mengetahui dan membedakan strain dari suatu mikroorganisme penyebab infeksi suatu penyakit.
• Ex: dalam suatu keluarga yang terkena TB,
• Apakah penularan pada anak disebabkan oleh penularan dari ayah.
• Atau ketika seseorang menderita suatu penyakit enam bulan lalu. Ingin diketahui apa ia sembuh dan terapinya berhasil.
• Pada pemeriksaan awal, dicek dan hasilnya dijadikan sebagai database untuk dibandingkan dengan pemeriksaan 6 bulan kemudian.
• Jika sama, pasien masih terinfeksi bakteri yang sama dan disimpulkan bahwa terapinya belum berhasil.

PCR

• PCR ibarat seperti pintu. Apakah mutasi ini dapat menyebabkan suatu penyakit itu hanya dapat dilakukan jika sampel diperbanyak hingga jutaan kopi.
• Dulu ditaruh dalam wadah berbeda-beda. 30 siklus, berarti 2 pangkat 30. Hasil akhirnya berupa miliaran kopi.

Memperbanyak DNA secara in vitro (di luar jaringan)

• Dibutuhkan primer, yaitu oligonukleotida sintetis yang dirancang untuk mengenali bagian DNA yang akan diamplifikasi à memungkinkan terjadinya polimerasi/ pemanjangan untai DNA. Diperlukan suhu tinggi untuk denaturasi DNA. Dibandingkan dengan probe, primer pada PCR harus memiliki syarat- syarat tertentu, yaitu memiliki panjang antara 21-23bp dan bisa melakukan annealing di suhu tertentu.

• Walaupun kita sudah mendesign primer dengan bantuan komputer pada kenyataan, ketika pCR akan menghasilkan hasil yang negatif karena primer yang dipake tidak bisa nempel pada dna target.

• Digunakan enzim DNA polimerase yang tahan pada suhu 95oC (misal enzim taq polymerase dari Thermus aquaticus yang berasal dari kawah à reaksi enzimatik dilakukan pada suhu ekstrem). Jadi, harus enzim yang tahan akan suhu yang panas karena enzim yang tidak tahan akan mengalami denaturasi.

Proses

1. Denaturasi: pemisahan untai ganda menjadi tunggal, terjadi pada suhu 90-950C
2. Annealing/Priming: perlekatan primer pada ssDNA target; pada suhu 50- 650C
3. Elongasi: reaksi polimerasi/pemanjangan rantai DNA; pada suhu 68-720C Di sini juga dapat kita lihat betapa menguntungkannya PCR ini karena dengan 6 siklus saja, dapat dihasilkan 64 kopi DNA. 30 siklus àmilyaran kopi.

Sekuensing DNA

• Dalam rekayasa genetik digunakan metode sekuensing untuk mengetahui urutan nukleotida pada Gen.
• Metode sanger; di mana dua utas dsDNA yang tidak diketahui urutan basa N nya, akan didenaturasi membentuk ssDNA.
• Salah satu untai akan dijadikan template untuk sintesis untai pasangannya.
• Intinya, dengan mengetahui satu untai DNA, dapat diketahui untai lainnya karena saling berkomplementer.
• ssDNA template kemudian ditambahkan banyak dNTP yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan DTTP.
• Ditambahkan pula primer untuk memulai sintesis dan enzim DNA polimerase untuk sintesis pasangan ssDNA yang menjadi template.
• Adonan ini kemudian diramu dan dibagi ke dalam empat tabung. Dengan demikian, setiap tabung memiliki ssDNA, dNTP yang kaya, serta enzim DNA polimerase yang sama rata.
• Yang berbeda, tabung I diberi ddATP yang diberi label dengan warna merah, tabung II dengan dTTP (biru), tabung III dengan dCTP (hijau), serta tabung IV dengan dGTP (kuning). Molekul ddNTP ini berbeda dengan dNTP karena tidak memiliki molekul O pada karbon 3’ dari ribosa, sehingga pemanjangan rantai
• DNA terhenti bila rantai mengikat ddNTP spesifik di masing-masing tabung tersebut (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau ddTTP) atau diterminasi.
• Hasilnya, ketika terjadi elongasi primer, dNTP akan berkompetisi dengan ddNTP dalam berikatan dengan basa N pada ssDNA sebagai template.
• Ex: Di ssDNA (template), sekuens basa N (setelah basa yang diduduki oleh primer) adalah GATCA. Pada tabung I yang berisi dATP dari dNTP dan ddATP sintesis akan berlangsung hingga mencapai posisi T, di mana dATP akan berkompetisi dengan ddATP untuk berikatan. Bila diduduki oleh dATP, sintesis tetap berlanjut. Bila tidak, ddATP yang mengikat, akan terjadi terminasi, sehingga sintesis berhenti, terbentuk fragmen, dengan ujung yang berwarna merah bila dianalisis.
• Hasil akhirnya berupa fragmen-fragmen yang terpotong di daerah tertentu akibat terminasi dengan berat molekul yang berbeda-beda à dielektroforesis, sehingga memberi warna yang berbeda. Hasilnya dapat dianalisis secara statistik. Komputer akan membaca urutan-urutan tersebut. Lihat yang mana yang paling atas.
• Dulu, orang melakukannya dengan cara diekspos ke suatu film dan dibaca satu per satu. Sekarang, cukup disinari dan akan ditangkap oleh sensor à dibaca, lalu disusun menjadi suatu grafik yang ditampilkan oleh layar komputer secara runut. Adakalanya antara basa N yang satu berhimpitan dengan yang lain, sehingga tinggal dibaca sinyal yang paling kuat.