TRANSPLANTASI GEN-TEKNIK PLASMID

Bioteknologi dalam rekayasa genetik


Vektor, berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus.

Pembuatan plasmid dan mekanisme penyisipan gen

Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri.

Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI (pemotong plasmid/ADN) dan enzim LIGASE (penyambung ptongan-potongan ADN)

• Langkah-langkah dalam rekayasa genetika untuk memproduksi insulin dalam Teknik Plasmid adalah sebagai berikut :

1. Masing-masing gen polipeptida alfa dan beta disintesis secara kimiawi.
2. Gen tersebut disisipkan pada plasmid E. coli yang direkayasa supaya memiliki operon laktosa, yaitu promoter, operator, dan gen struktural 2 yang mengkode ß-galaktosidase. Di samping itu, plasmid ini juga mengandung gen yang mengkode resistensi terhadap amfisilin yang berguna sebagai marker untuk menyeleksi sel yang mengandung plasmid.
3. Masing-masing gena alfa dan beta disisipkan ke dalam plasmid yang terpisah, yaitu pada bagian kanan gen z.
4. Plasmid tersebut lalu dimasukkan ke dalam sel E. coli untuk diekspresikan.
5. Ekspresi operon laktosa akan menyebabkan terbentuknya protein galaktosidase dan protein insulin yang saling berikatan hingga membentuk protein gabungan.
6. Selanjutnya protein gabungan ini dimurnikan lalu dipotong sehingga protein insulin terpisah dengan protein ß-galaktosidase.
7. Dengan cara ini akan diperoleh polipeptida alfa maupun polipeptida beta insulin.
8. Akhirnya polipeptida alfa diikatkan dengan polipeptida beta secara oksidasi. sehingga diperoleh insulin yang utuh dan siap untuk digunakan.

DETAIL

• Dalam pembahasan tentang teknik-teknik bioenginering istilah-istilah macam plasmid dan episom tentu kita harus tahu secara mendasar
• Sesungguhnya apa dan bagaimana sih plasmid itu ?

Dalam coretan catatan ini, secara ringkas akan diperjelas tentang hal teknologi bioteknologi yanng melibatkan Plasmid:

• Plasmid merupakan molekul DNA tambahan atau elemen DNA ekstra kromosomal.
• Plasmid berada di sitoplasma bakteri berupa DNA sirkuler ekstra kromosomal

• Episom merupakan unsur-unsur genetik bebas yang telah dapat berkembang dalam sel bakteri baik dalam keadaan autonom (menggandakan diri dan dipindahkan tanpa bergantung kepada kromosom bakteri) maupun pada keadaan terintegrasi (melekat pada kromosom bakteri
• Episom ini berperan serta bersamanya dalam rekombinasi genetika dan dipindahkan bersama kromosom bakteri tersebut.

• Baik Plasmid maupun episom memiliki fungsi yang penting dalam penelitian genetika maupun dalam perekayasaan gen.
• Plasmid memiliki struktur yang sama dengan DNA kromosom yang terdiri atas gen-gen yang mengkodekan sifat tertentu seperti resistensi terhadap antibiotik dan sebagainya.
• Plasmid memiliki bentuk sirkular untai ganda (umumnya), sirkular untai tunggal seperti pada bakteri gram positif dan berbentuk linier seperti pada genus Borellia dan Streptomyces.OK

• Plasmid melakukan replikasi sendiri dan memiliki dua tipe yaitu plasmid berukuran kecil (kurang dari 10 kb) dan terdapat dalam kopian berganda di dalam sel dan plasmid F yang berukuran lebih besar (lebih besar dari 30 kb; plasmid F sendiri berukuran 100 kb).
• Plasmid ini hanya memiliki satu atau dua kopian per sel. Plasmid F ini juga dikenal dengan plasmid konjugativ karena dapat ditransfer dari satu sel ke sel yang lain atau dapat menggabungkan dirinya ke dalam kromosom.

• Pengertian Plasmid dan Episom
• Pengertian Plasmid secara gamblang, Dale & Park (2004) menyebutkan bahwa plasmid merupakan molekul DNA tambahan atau elemen DNA ekstrakromosomal.
• Dalam Garner (1991) diterangkan bahwa plasmid merupakan replicon (sebuah unit dari materi genetik yang mampu melakukan replikasi secara mandiri) yang diwariskan secara stabil (dipertahankan tanpa seleksi tertentu) dan berada di luar kromosom (extra-chromosomal).

• Plasmid hanya dimiliki oleh organisme prokariot dan tidak dimiliki oleh organisme eukariot.
• Namun karena plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal, maka kromosom otonom seperti pada mitokondria dan kloroplas pada sel eukariot sebagian menganggap itu merupakan plasmid karena kromosom sebenarnya terdapat pada inti.
• Plasmid bakteri secara umum berada di dalam sel sebagai molekul DNA sirkular dengan penyesuaian yang sangat rapi, berkaitan dengan bentuk supercoil dari DNA.
• Pada beberapa kasus, plasmid merupakan molekul yang sangat kecil dengan panjang hanya beberapa kilobasa, tetapi pada beberapa organisme, khususnya genus Pseudomonas plasmid berukuran lebih dari beberapa ratus kilobasa.

Pengertian Episom

• Selain plasmid, yang akan dibahas pada makalah ini adalah episom.
• Episom merupakan unsur-unsur genetik bebas yang telah dapat berkembang dalam sel bakteri baik dalam keadaan autonom (menggandakan diri dan dipindahkan tanpa bergantung kepada kromosom bakteri) maupun pada keadaan terintegrasi (melekat pada kromosom bakteri, berperan serta bersamanya dalam rekombinasi genetika dan dipindahkan bersama kromosom bakteri tersebut) (Hakim, 2010).

• Pengertian di atas diperkuat oleh Garner (1991) yang menyebutkan bahwa episom merupakan elemen genetik yang memiliki dua alternatif cara replikasi
• Cara replikasi itu meliputi

1. sebagai bagian yang terintegrasi dalam kromosom utama
2. sebagai elemen genetik autonom yang independen (berdiri sendiri) dari kromosom utama.

• Dalam kamus britanica terdapat informasi tambahan bahwa dalam konjugasi bakteri, sel bakteri yang memiliki episom bertindak seolah-olah sebagai ‘pejantan’nya, sebab di dalam proses tersebut terjadi transfer episom atau episom beserta gen yang ditempelinya ke sel yang lain.

Perbedaan Antara Plasmid dan Episom

• Antara plasmid dan episom tidaklah sama, terdapat sebuah perbedaan mendasar diantara keduanya.
• Dalam Wiki.Answer (sebuah forum diskusi ilmiah di internet) menyimpulkan bahwa perbedaan antara plasmid dan episom sebagai berikut;
• Plasmid merupakan molekul DNA ekstra kromosom, plasmid tidak dapat bergabung dengan DNA kromosom, dan plasmid berisi informasi genetik yang diperlukan untuk replikasi plasmid itu sendiri.
• Sedangkan episom adalah setiap jenis DNA ekstra-kromosom yang dapat berhubungan dengan DNA kromosom.
• Episom biasanya lebih besar dari DNA ekstra-kromosom lainnya.
• Contoh episom adalah virus, karena mereka mengintegrasikan materi genetik mereka ke dalam DNA kromosom inang dan bereplikasi bersama dengan replikasi DNA kromosom inangnya.

Fungsi Plasmid dan Episom

• Sebagai komponen genetik extrakromosomal, plasmid memiliki beberapa peranan yang cukup penting, baik bagi bakteri yang memiliki plasmid itu sendiri maupun bagi penelitian di bidang genetika. D
• ale dan Park (2004) menyebutkan bahwa plasmid menyediakan sebuah dimensi ekstra yang penting terhadap fleksibilitas respon organisme terhadap perubahan lingkungan, baik perubahan itu bersifat antagonis atau berlawanan (misalnya kehadiran antibiotik) maupun yang berpotensi menguntungkan atau baik, misalnya ketersediaan substrat baru.

• Beberapa kegunaan plasmid yang lain bagi bakteri seperti: produksi protein yang berfungsi sebagai zat antimikrobial untuk melawan organisme bakteri yang saling berdekatan misalnya Colicin yang diproduksi oleh E. Coli strain tertentu untuk membunuh bakteri E. Coli yang lain; plasmid membawa sifat virulensi bagi bakteri; bakteri-bakteri tertentu seperti Agrobacterium tumefaciens membawa plasmid yang disebut TI (Tumor Inducing) yang bersifat patogen yang menyebabkan tumor pada tumbuhan dan Rhizobium yang membentuk nodul pada akar kacang-kacangan yang berguna untuk fiksasi nitrogen dikontrol oleh gen-gen yang dibawa oleh plasmid. Selain itu juga, plasmid membawa gen-gen yang digunakan oleh beberapa bakteri dalam aktivitas metabolisme seperti fermentasi laktose dan proses biodegradasi dan bioremidiasi.

• kondisi lingkungan Secara umum, plasmid memiliki peran penting di dalam menberikan kemampuan adaptif yang kuat bagi bakteri. Sesuai dengan sifat plasmid yang dapat keluar atau masuk ke dalam sel bakteri, hal ini memungkinkan bakteri dapat memiliki sifat-sifat genetik dan juga sifat-sifat metabolis yang menguntungkan pada yang baru.

• Dari segi penelitian genetika, plasmid telah lama dikenal sebagai vektor dalam teknik rekayasa genetika. Contoh yang cukup popular adalah bakteri penghasil insulin, bakteri ini dihasilkan dengan menanamkan plasmid yang telah di modifikasi dengan disisipi gen pengkode insulin, dengan memiliki plasmid tersbut, bakteri itu mampu memproduksi insulin. Selain itu masih banyak contoh-contoh lain terkait manfaat plasmid di bidang penelitian genetika.

• Sedikit berbeda dengan pada plasmid, umumnya episom justru merugikan sel inang, terutama jika episome tersebut merupakan virus. Sebagaimana kita ketahui pada daur replikasi virus, saat materi genetik virus tersebut masuk ke dalam sel inang dan segera menyisip pada kromosom inti kemudian mengambil kendali sel inang sehingga akhirnya membentuk virion-viron baru. Tentu saja proses ini merugikan bagi sel inang, apalagi jika daur tersebut berakhir dengan lisisnya sel inang.

• Namun beberapa episom virus ternyata diketahui dapat berada dalam kondisi dorman (viral episomal latency), sebagaimana yang disebutkan di dalam wikipedia (2011) bahwa viral episomal latency merupakan kondisi dimana materi genetik virus yang telah masuk ke dalam sel inang, hanya melayang-layang (floating) di dalam sitoplasma sel inang. Dalam kondisi ini episom virus tersebut tidak memberikan bahaya yang serius bagi sel inang.

• Dalam bidang rekayasa genetika, episome memberikan manfaat yang cukup besar. Seperti halnya plasmid episom seringkali digunakan untuk menyuntikkan gen-gen tertentu ke dalam kromosom sel target sehingga, dengan demikian sel target akan memiliki sifat-safat yang dibawa gen tadi. Dalam hal ini, penggunaan episom memberikan hasil yang sedikit berbeda dengan plasmid, dimana gen yang disuntikkan akan bergbung bersama pada DNA utama pada sel target.

Struktur Serta Replikasi Plasmid dan Episom

• Plasmid memiliki bentuk sirkular dan melakukan replikasi sendiri.
• Plasmid berada di dalam sel dan replikasinya seperti replikasi DNA seluler.
• Plasmid merupakan DNA yang membawa sejumlah gen. sedikit berbeda dengan plasmid,

• Episom merupakan materi genetik ektra kromosomal yang dapat menyisip pada kromosom utama sel induk.
• Secara struktur episom bergabung dan menyatu dengan kromosom sel induk.
• Ilustrasi struktur plasmid dan episom dapat dilihat pada gambar berikut;

• Plasmid pada E.Coli terdiri atas dua tipe yaitu tipe pertama disebut ColE1
• ColE1 berukuran relatif kecil (kurang dari 10 kb) dan terdapat dalam kopian berganda di dalam sel
• Kelompok plasmid kedua digolongkan ke dalam plasmid F yang berukuran lebih besar (lebih besar dari 30 kb; plasmid F sendiri berukuran 100 kb).
• Plasmid ini hanya memiliki satu atau dua kopian per sel
• Plasmid ini juga dikenal dengan plasmid konjugatif.

• Replikasi plasmid tipe pertama tidak berhubungan dengan proses replikasi kromosomal dan pembelahan sel (oleh sebab itu memiliki jumlah kopian yang banyak), meskipun ada beberapa pengontrol dalam replikasi plasmid.
• Sedangkan plasmid tipe kedua, replikasinya dikontrol dengan cara yang sama seperti pada kromosom.
• Karenanya, ketika kromosom diinisiasi untuk bereplikasi, maka replikasi plasmid ini pun akan terjadi. Oleh karena itu plasmid tipe ini tidak bisa diamplifikasi (perbanyakan).

• Struktur plasmid ColE1. imm: gen untuk memproduksi colicin E1 dan imunitasnya; mob: gen yang mengkode nuklease untuk mobilisasi; rom: gen yang mengkode protein yang dibutuhkan untuk efektivitas jumlah kopian; oriT: origin of conjugal tansfer; oriV: origin of replication. (Gutman, 2004)

Gambar Plasmid tipe 1, plasmid dengan jumlah kopian berganda dengan pembagian acak.

Gambar Plasmid tipe 2, plasmid dengan jumlah kopian sedikit dengan pembagian terarah.

• Model replikasi plasmid sama dengan kromosom (Gambar 2.3).
• Banyak plasmid direplikasi sebagai molekul sirkular untai ganda.
• Replikasi dimulai dari titik yang disebut oriV (vegetative origin, yang membedakannya dengan titik transfer konjugative yaitu oriT) dan prosesnya berasal dari titik ini dalam satu maupun dua arah secara simultan sampai seluruh lingkaran dikopi.

Gambar Model replikasi plasmid untai ganda. Replikasi dimulai dari titik awal replikasi yaitu oriVI dan diakhiri pada titik akhir replikasi yaitu oriT.

• Replikasi pada plasmid untai tunggal terjadi pada beberapa bakteri seperti bakteri gram positif yang memiliki plasmid untai tunggal.
• Model replikasi plasmid untai tunggal dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar Model replikasi plasmid untai tunggal.

• Berawal dari untai tunggal yang disebut untai (+) disitensis untai komplementer yaitu untai (-) membentuk untai ganda (formasinya disebut RF).
• Dari bentuk RF kemudian disintesis kopian plasmid untai tunggal. Siklus berlanjut dan membentuk untai tunggal berikutnya.

• Plasmid juga memiliki bentuk liner seperti yang dicirikan pada beberapa genus bakteri yaitu Borrelia dan Streptomyces.
• Gambar berikut menjelaskan bagaimana replikasi plasmid linier pada Borrelia.

Gambar Model replikasi plasmid linier pada Borrelia.

• Replikasi berawal dari bagian oriC (origin of replication central) membentuk struktur dimerik sirkular.
• Struktur dimerik sirkular dipotong, sehingga menghasilkan satu plasmid linier yang baru.

Gambar Integrasi dan pemotongan plasmid F. Integrasi terjadi melalui rekombinasi dengan bagian kromosom (a-c).

• Pemotongan akurat terjadi pada bagian yang sama, tetapi rekombinasi dengan bagian kromosom yang berbeda menghasilkan penggabungan DNA kromosom (pada kasus ini gen lac) ke dalam plasmid (d-e) membentuk sebuah plasmid F’ dan menyebabkan delesi kromosom.

BACA LITERASI INI

Penyisipan gen pada suatu tanaman membutuhkan proses yang sulit dan panjang. Untuk menyisipkan sebuah gen pada sel tumbuhan, kita membutuhkan vektor tertentu. Vektor adalah organisme yang berfungsi sebagai kendaraan pembawa materi genetik yang akan disisipkan. Sel tumbuhan tidak memiliki plasmid seperti bakteri sehingga pilihan vektor yang berpotensi untuk memasukkan gen ke dalam sel tanaman juga terbatas. 

Sejauh ini, vektor terbaik untuk menyisipkan gen pada tanaman adalah Agrobacterium tumefaciens. Hal ini karena bakteri tersebut memiliki Ti-plasmid (Tumor Inducing Plasmid) yang dapat berintegrasi ke dalam DNA tumbuhan.

Ilustrasi penyisipan gen pada tanaman.
Gambar dari: Biology, 7th Edition, Raven dkk, New York: McGraw Hill Higher Education (2005).

Berikut ini adalah langkah-langkah dalam menyisipkan gen pada suatu sel tanaman :

1. Ti-Plasmid yang terdapat pada bakteri Agrobacterium dikeluarkan dari sel bakteri Agrobacterium kemudian dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi.
2. Isolasi DNA pengkode protein (gen) yang kita inginkan dari organisme tertentu.
3. Sisipkan gen yang kita inginkan tersebut pada plasmid dan rekatkan dengan enzim DNA ligase.
4. Masukkan kembali plasmid yang sudah disisipi gen ke dalam bakteri Agrobacterium.
5. Plasmid yang sudah tersisipi gen akan terduplikasi pada bakteri Agrobacterium.
6. Selanjutnya, bakteri akan masuk ke dalam sel tanaman dan mentransfer gen.
7. Kemudian, sel tanaman akan membelah. Tiap-tiap sel anak akan memperoleh gen baru dalam kromosom dari sel tanaman dan membentuk sifat/karakteristik yang baru (yang sesuai dengan gen yang disisipkan).

Itulah suatu gambaran sederhana bagaimana suatu proses penyisipan gen. Sementara itu, proses transformasi gen pada plasmid ke sel tanaman dan proses perbanyakan (multiplikasi) sel-sel tanaman dapat kita simak pada gambar di bawah.

Transformasi gen pada plasmid ke sel tanaman.

Gambar dari: An Introduction to genetic analysis, Griffiths dkk, New York: W.H. Freeman (1996).

Dari gambar di atas, dapat diamati bahwa bakteri yang telah terintegrasi dengan Ti-plasmid akan dimasukkan ke dalam potongan kecil dari sel tanaman/eksplan (misalnya potongan kecil dari daun). Metode untuk memasukkan DNA plasmid yang terdapat pada sel bakteri ke dalam sel tanaman ini disebut dengan transformasi. Di sini, gen pengkode protein tertentu yang sudah bergabung pada Ti Plasmid akan tersisip pada kromosom tanaman.

Selanjutnya, eksplan yang sudah memiliki gen tertentu tersebut akan dikulturkan/dibiakkan secara in vitro (di luar tubuh tanaman, misalnya pada cawan petri). Eksplan dari tanaman tersebut akan tumbuh menjadi kalus (kumpulan sel) yang dapat diinduksi untuk membentuk batang dan akar. Kalus ini akan tumbuh menjadi plantlet (tanaman kecil). Plantlet kemudian akan tumbuh menjadi individu tanaman transgenik yang bisa ditanam di tanah.

Lalu, bagaimana cara mendeteksi bahwa gen tersebut sudah berhasil masuk ke dalam sel tanaman dan menjadi tanaman transgenik?

Untuk mendeteksi gen pengkode protein tertentu yang kita inginkan sudah masuk atau belum ke dalam suatu tanaman, kita membutuhkan tes/ujicoba. Misalnya, jika yang kita sisipkan itu adalah gen pengkode kanamycin, kita dapat memasukkan kanamycin ke dalam suatu medium dan meletakkan sel tanaman yang sudah disisipi gen pengkode kanamycin. Tanaman yang sudah tersisipi gen pengkode kanamycin akan tumbuh di medium tersebut, sedangkan sel tanaman yang tidak tersisipi tidak akan tumbuh dalam medium tersebut.

Apa ya contoh tanaman transgenik?

Salah satu contohnya adalah Golden Rice (beras emas). Golden Rice ini adalah hasil penelitian seorang ilmuwan rekayasa hayati (bioengineer) asal Swiss, Ingo Potrykus (Swiss Federal Institute of Technology) dan Peter Beyer (University of Freiburg). Golden Rice ini berbeda dengan beras biasa yang berwarna putih karena warnanya kekuningan. Mengapa bisa demikian? Ini karena beras tersebut disisipi gen yang dapat membentuk beta-carotene, sumber vitamin A. Beras ini diciptakan untuk mengurangi defisiensi vitamin A yang mengakibatkan sekitar 250 juta anak kecil usia di bawah 5 tahun meninggal dunia di berbagai belahan dunia, terutama di negara berkembang yang mayoritas makanan utamanya adalah nasi (yang terbuat dari beras).

Pertama-tama, Potrykus mengidentifikasi masalah mengapa beta-carotene tidak dihasilkan oleh tanaman padi. Ia kemudian menemukan bahwa tanaman padi hanya bisa setengah jalan dalam pembuatan beta carotene karena tidak ada enzim di dalam tanaman padi yang dapat mengkatalisis empat tahap terakhir. Oleh karena itu, ditambahkanlah gen yang dapat memfasilitasi sintesis beta-carotene yang berasal dari bunga bakung/Daffodil (Narcissus pseudonarcissus). Selain itu, untuk melengkapi proses pembentukan beta-carotene, ditambahkan pula gen dari bakteri Erwinia uredovora, yaitu gen yang menyintesis enzim untuk jalur pembentukan beta-carotene.

Bagaimana dengan permasalahan lainnya? Selain vitamin A, Potrykus juga berpikir mengapa padi memiliki kadar zat besi yang begitu rendah dan mencari solusi dari pertanyaan tersebut. Potrykus kemudian berinisiatif untuk menambahkan gen Ferritin yang berasal dari kacang ke dalam gen padi untuk meningkatkan kadar zat besi; gen methallotionin yang terdapat pada tanaman padi liar (wildtype) untuk meningkatkan persediaan protein sulfur guna meningkatkan proses penyerapan zat besi; serta gen Phytase (berasal dari jamur Aspergillus fungus) yang berfungsi untuk menghancurkan enzim Phytate (penghambat reabsorpsi zat besi).

Lalu, apakah tanaman transgenik ini aman untuk dikonsumsi? Dan bagaimana dampak tanaman transgenik terhadap lingkungan?

Masih banyak pro dan kontra tentang tanaman transgenik ini di masyarakat luas. Hal ini disebabkan karena masyarakat dunia masih banyak yang takut jika tanaman pangan transgenik ini berbahaya. Dari data yang didapat, risiko bahaya pada persediaan makanan transgenik sebenernya terlihat sangat kecil sehingga Genetically Modified Food (makanan yang termodifikasi secara genetik) ini cukup aman.

Di Eropa, pemberian label terhadap tanaman pangan transgenik adalah suatu keharusan. Hal ini disebabkan oleh ketakutan masyarakat Eropa akan manipulasi genetik sebagai sesuatu hal yang tidak biasa. Berbeda halnya dengan di Amerika, tanaman pangan transgenik tidak memerlukan pelabelan untuk saat ini.

Tanaman transgenik juga hanya memiliki dampak kerusakan yang sangat kecil dibanding pestisida. Contohnya, jagung transgenik (Bt corn). Pada jagung ini disisipkan gen yang dapat menghasilkan toksin pembunuh serangga (gen ini tidak berbahaya pada manusia). Memang toksin yang dihasilkan tersebut dapat membunuh kupu-kupu atau serangga lainnya. Akan tetapi, ini jauh lebih aman dibanding pestisida yang bisa membunuh semua serangga bahkan binatang lain. Hingga saat ini, para ilmuwan masih terus melakukan peningkatan kualitas tanaman transgenik. Tentu diharapkan nantinya tanaman transgenik ini bisa lebih tidak berbahaya dan ramah lingkungan